纳米孔测序新突破！南京大学利用纳米孔绘制RNA修饰图谱

除了经典的核糖核苷酸A、U、C、G，生物体内还有大量的遗传修饰核苷酸，即所谓的表观遗传修饰。它们像篱笆上的灯笼一样装饰着RNA，调节着基因表达、mRNA剪接、疾病发生等各种重要的生命过程。

到目前为止，科学家已经成功鉴定了170多种表观遗传修饰，但这些只是冰山一角。为了在转录组水平实现完整修饰的作图，自然细胞生物学和分子生物学的封面综述呼吁开发一种方法来直接定位和定量RNA的所有表观遗传修饰。

RNA修饰分析可以通过薄层色谱（TLC）、高效液相色谱-紫外分光光度法（HPLC-UV）或高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）进行。这些方法可以同时测量大量的RNA修饰，但很难提供序列信息。基于第二代测序（NGS）的方法可以通过抗体免疫沉淀或化学修饰来绘制整个转录组的RNA修饰图谱。这些方法只能检测有限种类的修改，并且通常只针对一种特定的修改。仍有大量的RNA修饰无法检测或定位。

新兴的纳米孔测序技术可以直接对长链RNA进行测序，无需逆转录和PCR扩增，有望直接读取RNA上所有的修饰信息。然而，由于通道分辨率有限，修饰核苷酸引起的离子电流变化也与其周围序列有关，这为准确判断修饰的类型和位置以及同时检测多个修饰带来了挑战。

近日，南京大学化学化工学院黄硕教授团队发表了一篇研究论文，题目为：在NatureNanotechnology中使用工程化纳米孔识别核苷单磷酸及其表观遗传修饰。

本研究构建了一种高分辨率的耻垢分枝杆菌膜蛋白A（MspA）纳米孔，可以准确识别所有经典核苷酸及其主要修饰。野生MspA纳米孔是天然的八聚体，如何在其中引入独特的功能位点尚未见报道。

研究团队通过原核共表达系统成功将一种含半胱氨酸突变的单体引入八聚体，实现了异质MspA纳米孔的构建。然后通过马来酰亚胺苯硼酸与巯基的迈克尔加成反应，进一步将唯一的苯硼酸适体引入通道。利用苯硼酸和顺式二醇对核苷酸的可逆相互作用，研究团队完全区分了四种经典核苷酸（C、U、A、G），其效果远优于现有报道，充分证明了非均相MspA通道检测核苷酸的可行性和高分辨率。

研究团队进一步将该方法应用于RNA表观遗传修饰的检测，实现了多达7种常见修饰核苷酸的同时检测，包括5-甲基胞苷（m5C）、N6-甲基腺苷（m6A）、N7-甲基鸟苷（m7G）、N1-甲基腺苷（m1A）、肌苷（I）等。

这是nanopore首次报道对如此多种核苷酸修饰的直接检测和完美区分，充分展示了MspA对微小结构差异甚至修饰异构体的优异分离度。该方法理论上适用于各种核苷酸、核苷酸修饰和核苷酸衍生物的检测。

随后，研究团队开发了RNA表观遗传修饰信号数据库的机器学习算法，以辅助纳米孔事件的自动识别。通过选取每种核苷酸的500个标准事件作为训练集，并对各种机器学习模型进行评估，研究团队获得了最优的线性SVM模型。该模型能以99.6%的准确率区分11种核苷酸，并能识别混合核苷酸样品的成分，为真实环境下的核苷酸检测提供了自动化数据分析工具。

为了直接检测RNA的修饰，研究小组开发了一种“拆成几部分“的方法来检测天然RNA的完整修饰图谱。他们利用核酸外切酶将天然RNA消化成单个核苷酸，然后利用高分辨率纳米孔检测和机器学习分析，获得消化产物中核苷酸的组成和丰度，最终重构出原始RNA的序列组成和修饰信息。利用这一策略，研究团队成功检测到胃肠道肿瘤患者MicroRNA中的m5C和m6A修饰，为直接识别microRNA中的表观遗传修饰提供了一种快速便捷的单分子分析方法。

为了进一步扩大该策略的普适性，研究小组将其应用于tRNA修饰图谱的检测。作为高度修饰RNA的代表，tRNA中已鉴定出90多种修饰类型。以酵母苯丙氨酸tRNA为例，成熟的酵母苯丙氨酸tRNA含有11个化学修饰，包括D、、m5C、m7G、m1A、m22G、m2G、T、Y、Cm和Gm。Cm和Gm不能被苯硼酸修饰的MspA纳米孔检测到，因为它们的结构中缺少顺式二醇。通过感知酵母苯丙氨酸tRNA的消化产物，团队成功绘制了酵母苯丙氨酸tRNA的修饰图谱，并确定了其余9个修饰的存在，其丰度与理论结果基本一致。

该方法无需对RNA消化产物进行预分离，即可快速定量鉴定天然RNA中已知和未知的修饰，为发展切割测量的纳米孔表观遗传测序提供了重要的设计策略和研究方法。

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